机械网--ELISA技术的-操作要点

良好的试剂，良好的仪器和正确的操作是保证ELISA检测结果准确可靠的必要条件。ELISA的操作因固相载体的构成不同而有所差异，国内医学检验1般均用板式点。本文将叙述板式ELISA各个操作步骤的注意要点，珠式、管式及磁性球ELSIA，国外试剂均与特殊仪器配合利用，2者均有详细的使用说明，严格遵照规定操作，必能得出准确的结果。4.1标本的采取和保存可用作ELISA测定的标本10分广泛，体液（如血清）、分泌物（唾液）和排泄物（如尿液、粪便）等都可作标本以测定其中某种抗体或抗原成份。有些标本可直接进行测定（如血清、尿液），有些则需经预处理（如粪便和某些分泌物）。大部分ELISA检测均以血清为标本。血浆中除尚含有纤维蛋白原和抗凝剂外，其他成份均同等于血清。制备血浆标本需借助于抗凝剂，而血清标本只要待血清自然凝固、血块收缩后即可取得。除特殊情况外，在医学检验中均以血清作为检测标本。在ELISA中血浆和血清可同等利用。血清标本可按常规方法搜集，应注意避免溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以HRP为标记的ELISA测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色。血清标本宜在新鲜时检测。如有细菌污染，菌体中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应。如在冰箱中保存太久，其中的可产生聚合，在间接法ELISA中可使本底加深。1般说来，在5天内测定的血清标本可放置于4℃，超过1周测定的需低温冰存。冻结血清融解后，蛋白质局部浓缩，散布不均，应充分混匀宜轻缓，避免气泡，可上下颠倒混和，不要在混匀器上强烈振荡。混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再检测。反复冻融会使抗体效价跌落，所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冰存。保存血清自搜集时就应注意无菌操作，也可加入适当防腐剂。4.2试剂的准备按试剂盒说明书的要求准备实验中需用的试剂。ELISA中用的蒸馏水或去离子水，包括用于洗涤的非法用地被强拆怎么办，应为新鲜的和高质量的。自配的缓冲液利用pH计丈量较正。从冰箱中取出的实验用试剂应待温度与室温平衡后使用。试剂盒中本次实验不需用的部分应及时放回冰箱保存。4.3加样在ELISA中1般有3次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。加样时应将所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。加标本1般用微量加样器，按规定的量加入板孔中。每次加标本应更换吸嘴，以免产生交叉污染，也可用1次性的定量塑料管加样。有此测定（如间接法ELISA）需用稀释的血清，可在试管中按规定的稀释度稀释后再加样。也可在板孔中加入稀释液，再在其中加入血清标本，然后在微型震荡器上震荡1分钟以保证混和。加酶结合物利用液和底物利用液时可用定量多道加液器，使加液进程迅速完成。4.4保温在ELISA中1般有两次抗原抗体反应，即加标本和加酶结合物后被强拆后该如何挽回损失。抗原抗体反应的完成需要有1定的温度和时间，这1保温进程称为温育(incubation)，有人称之为孵育，在ELISA中似不恰当。ELISA属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上产生。以抗体包被的夹心法为例，加入板孔中的标本，其中的抗原其实不是都有均等的和固相抗结合的机会，只有最贴近孔壁的1层溶液中的抗原直接与抗体接触。这是1个逐步平衡的进程，因此需经分散才能到达反应的终点。在其后加入的酶标记抗体与固相抗原的结合也1样如此。这就是为什么ELISA反应总是需要1定时间的温育。温育常采取的温度有43℃、37℃、室温和4℃（冰箱温度）等。37℃是实验室中常常使用的保温温度，也是大多数抗原抗体结合的合适温度。在建立ELISA方法作反应动力学研究时，实验表明，两次抗原抗体反应1般在37℃经1⑵小时，产物的生成可达顶峰。为加速反应，可提高反应的温度，有些实验在43℃进行，但不宜采取更高的温度。抗原抗体反应4℃更加完全，在放射免疫测定中多使反应在冰箱中过夜，以构成最多的沉淀。但因所需时间太长，在ELISA中1般不予采取。保温的方式除有的ELISA仪器附有特制的电热块外，1般均采取水浴，可将ELISA板置于水浴箱中，LISA板底应贴着水面，使温度迅速平衡。为避免蒸发，板上应加盖，也可用塑料贴封纸或保鲜膜覆盖板孔，此时可让反应板漂浮在水面上。若用保温箱，ELISA板应放在湿盒内，湿盒要选用传热性良好的材料如金属等，在盒底垫湿的纱布，最后将ELISA板放在湿纱布上。湿盒应先放在保温箱中预温至规定的温度，特别是在气温较低的时候更应如此。不论是水浴还是湿盒温育，反应板均不宜叠放，以保证各板的温度都能迅速平衡。室温温育的反应，操作时的室温应严格限制在规定的范围内，标准室温温度是指20⑵5℃，但具体操作时可根听说明书的要求控制温育。室温温育时，ELISA板只要平置于操作台上即可。应注意温育的温度和时间应按规定力求准确。为保证这1点，1个人操作时，1次不宜多于两块板同时测定。4.5洗涤洗涤在ELISA进程中虽不是1个反应步骤，但却也决定着实验的成败。ELSIA就是靠洗涤来到达分离游离的和结合的酶标记物的目的。通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质，和在反应进程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时又应把这类非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。可以说在ELISA操作中，洗涤是最主要的关键技术，应引发操作者的高度重视，操作者应严格按要求洗涤，不得马虎。洗涤的方式除某些ELISA仪器配有特殊的自动洗涤仪外，手工操作有浸泡式和流水冲洗式两种，进程以下：（1）浸泡式a.吸干或甩干孔内反应液；b.用洗涤液过洗1遍（将洗涤液注满板孔后，即甩去）；c.浸泡，即将洗涤液注满板孔，放置1⑵分钟，间歇摇动，浸泡时间不可随意缩短；d.吸干孔内液体。吸干应完全，可用水泵或真空泵抽吸，也可甩去液体后在清洁毛巾或吸水纸上拍干；e.重复操作c和d，洗涤3⑷次（或按说明规定）。在间接法中如本底较高，可增加洗涤次数或延长浸泡时间。微量滴定板多采取浸泡式洗涤法。洗涤液多为含非离子型洗涤剂的中性缓冲液。聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是疏水性的，非离子型洗涤剂既含疏水基团，也含亲水基团，其疏水基团与蛋白质的疏水基团借疏水键结合，从而削弱蛋白质与固相载体的结合，并借助于亲水基团和水分子的结合作用，使蛋白质回复到水溶液状态，从而脱离固相载体。洗涤液中的非离子型洗涤剂1般是吐温20，其浓度可在0.05%-0.2%之间，高于0.2%时，可使包被在固相上的抗原或抗体解吸附而减低实验的灵敏度。（2）流水冲洗式流水冲洗法最初用于小珠载体的洗涤，洗涤液仅为蒸馏水乃至可用自来水。洗涤时附接1特殊装置，使小珠在流水冲击下不断地转动淋洗，延续冲洗2分钟后，吸干液体，再用蒸馏水浸泡2分钟，吸干即可。浸泡式犹如盆浴，流水冲洗式则好比淋浴，其洗涤效果更加完全，且也简便、快速。已有实验表明，流水冲洗式1样也适用于微量滴定板的洗涤。洗涤时想法加大水流量或加大水压，让水流冲击板孔表面，洗涤效果更佳。4.6显色和比色4.6.1显色显色是ELISA中的最后1步温育反应，此时酶催化无色的底物生成有色的产物。反应的温度和时间还是影响显色的因素。在1定时间内，阴性孔可保持无色，而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。适当提高温度有助于加速显色进行。在定量测定中，加入底物后的反应温度和时间应按规定力求准确。定性测定的显色可在室温进行，时间1般不需要严格控制，有时可根据阳性对照孔和阴性对照孔的显色情况适当缩短或延长反应时间，及时判断。OPD底物显色1般在室外温或37℃反应20⑶0分钟后即不再加深，再延长反应时间，可使本底值增高。OPD底物液受光照会自行变色，显色反应应避光进行，显色反应结束时加入终止液终止反应。OPD产物用硫酸终止后，显色由橙黄色转向棕黄色。TMB受光照的影响不大，可在室温中置于操作台上，边反应视察结果。但为保证实验结果的稳定性，宜在规定的适当时间阅读结果。TMB经HRP作用后，约40分钟显色达顶峰，随即逐渐减弱，至2小时后即可完全消退至无色。TMB的终止液有多种，叠氮钠和102烷基硫酸钠（SDS）等酶抑制剂都可以使反应终止。这类终止剂尚能使蓝色保持较长时间（12⑵4小时）不褪，是目视判断的良好终止剂。另外，各类酸性终止液则会使蓝色转变成黄色，此时可用特定的波长（450nm）测读吸光值。4.6.2比色比色前应先用洁净的吸水纸拭干板底附着的液体，然后将板正确放入酶标比色仪的比色架中。以软板为载体的实验，需先将板置于标准96孔的座架中，才可进行比色。最好在加底物液显色前，先将软板边沿剪净，这样，此板即可完全平妥坐入座架中。比色时应先以蒸馏水校零点，测读底物孔（未经任何反应仅加底物液的孔）和空白孔（以生理盐水或稀释液代替标本作全进程的孔），以记录本次实验的试剂状态。其后可用空白孔以蒸馏水校零点，以上各孔的吸光度需减去空白孔的吸光度，然落后行计算。比色结果的表达以往通用光密度（oplicaldensity，OD），现按规定用吸光度（absorbence，A），2者含义相同。通常的表示方法是，将吸收波长写于A字母的右下角，如OPD的吸收波长为492nm，表示方法为"A492nm"或"OD492nm"。<资讯分类行业动态帮助文档展会专题报道五金人物商家文章